נוסח הברכה וההוראה עליה מופיעים בספר במדבר ו 22-27: "וידבר ה' אֶל משה לאמר: דַּבֵּר אל אהרן ואל בָּנָיו לאמר כה תְבָרֲכוּ את בני ישראל אָמוֹר להם: יְבָרֶכְךָ ה' וְיִשְׁמְרֶךָ: יָאֵר ה' פניו אליך וִיחֻנֶּךָּ: יִשָּׂא ה' פָּנָיו אליך וְיָשֵׂם לְךָ שָׁלוֹם: וְשָׂמוּ אֶת שמי על בני ישראל וַאנִי אֲבָרֲכֵם:"

לאחר הקרבת קורבן התמיד נהגו הכוהנים במקדש לברך את העם בברכת כוהנים. יש המשערים כי בדורות האחרונים של ימי בית המקדש השני נאמרה ברכת כוהנים בעת התפילה, ולאחר הקריאה בתורה - גם בבתי הכנסת בארץ ישראל. לאחר החורבן תיקן רבן יוחנן בן זכאי כי על הכוהנים לחלוץ את סנדליהם כאשר הם מברכים את העם בבית הכנסת. בכך השווה את עבודת האל בבית הכנסת לעבודת האל בבית המקדש, שכן הכוהנים עבדו בבית המקדש כשהם מהלכים יחפים.